Modification du site actif de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase oar mutagénèse dirrigée : Etude du rôle de la Cys 149 et de l'His 176 dans le mécanisme enzymatique

Abstract

La Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPD) est une enzyme tétramérique, à cofacteur NAD⁺ intervenant dans le cycle glycolytique. Elle catalyse la phosphorylation oxydative du d-glycéraldéhyde-3-phosphate en acide 1-3 diphosphoglycérique. Dans ce mémoire enzymatique, deux acides aminés, dits catalytiques jouent un rôle essentiel : la cysteine 149 et l’histidine 176. En nous appuyant sur la structure tridimensionnelle déterminée à haute résolution de l’enzyme de Bacillus stearothermophilus et en appliquant la technique de mutagénèse dirigée sur le gène de l’enzyme de E. coli, nous avons remplacés l’histidine 176 par une asparagine et la cys 149 par une glycine et une sérine. L’analyse des mutants a été effectuée à l’aide de deux modèles chimiques : l’iodoacétamide (IAM) et le p-nitrophénylacétate (pNPA). Le rôle de l’histidine 176 en tant qu’activateur de la réactivité de la cystéine 149 a été démontré grâce à l’IAM : formation d’une paire d’ion avec le cystéine 149 et abaissement du pka de cette dernière. Ce même rôle a pu être confirmé par le deuxième modèle (pNPA). Cependant, il n’a pas été possible par cette approche de démontrer de façon claire le rôle de catalyseur base de l’histidine 176. Le rôle essentiel de la cystéine 149 en tant que nucléophile permettant la formation de l’intermédiaire thiohémicétal a pu être confirmé : - Le mutant GAPDH Gly 149 est inactif. - Le mutant GAPDH Ser 149 s’est avéré peu actif et présenter des activités chimiques différentes e celle de l’enzyme sauvage aussi bien vis-à-vis de l’IAM que pNPA. L’entité réactive doit être l’alcoolate, l’histidine 176 ne semble pas interagir avec la Ser 149.