Étude de l’embryogenèse somatique in situ et in vitro chez le citrange troyer (citrus sinensis x poncirus trifoliata) : aspects fondamentaux et applications

Abstract

Un protocole expérimental d’embryogenèse somatique et de régénération de plantules du Citrange troyer a été mise en place à partir de cals formés sur des hypocotyles de plantules issues du développement d’embryons nucellaires (EN) : ces cals ont été induites sur des hypocotyles de plantules mesurant 20-30 mm cultivés sur le milieu de Murashige et Tucker (MT) additionné de saccharose (20 gl₋₁) et d’acide gibbérellique (1 mgl ₋₁) ; ils ont ensuite été transférés sur le milieu MT additionné de lactose ou de galactose (50 gl₋₁) sur lequel des embryons somatiques (ES) ont été formés. L’embryogenèse a consisté à former une ‘’ banque’’ callogène sur le milieu MT solide ou liquide contenant 50gl ₋₁ de saccharose et de l’extrait de malt : la cal n’ayant pas perdu des potentialités embryogenèse, les RS sont différenciés après transfert sur le milieu MT contenant du lactose. Les vitro plants se sont formés lorsque les ES ont été cultivés sur le milieu MT additionné de 20 gl₋₁ de saccharose et de 1 mgl ₋₁ d’acide gibbérellique. L’observation en microscopie à fluorescence et l’utilisation de la coloration au bleu d’aniline et de l’immunofluorescence ont permis de caractériser la présence de la callose dans les parois cellulaires des cellules initiales des embryons nucellaires. Ce polysaccharide se dépose après la mise en place de la cellule mère des mégaspores, qui présente également une épaisse paroi callosique, et avant l’ouverture des fleurs. La callose a également été observée dans les cals autour des cellules embryogenèses et autour de proembryons. La microscopie électronique à Balayage a montré un réseau fibrillaire extracellulaire autour des cellules embryogènes et des proembryons non encore épidermisés. Le réseau disparait après la différenciation du protoderme. Il n’existe pas dans les conditions non embryogènes ce réseau est éliminé par l’action de protéase, du tampon Tris-HCI, de la colchicine et du froid et est reconstitué après un retour des cultures dans les conditions inductrices initiales. Ces observations indiquent que le réseau est lié au cytosquelette, constituant ainsi une similitude avec la matrice extracellulaire des animaux. Comme il n’apparait que pendant les premières étapes de la formation d’un embryon, il pourrait constituer, comme la callose, un marqueur précoce de l’embryogenèse. Les protéines extracellulaires ont été étudiées par la méthode e l’électrophorése 2D-PAGE sur des cals cultivées dans les milieux liquides. Dans les milieux embryogènes, deux polypeptides de 31.6 KDa ont été détectés dans le milieu. Ces 2 polypeptides sont absents dans les milieux non-embryogènes. Des cals embryogènes et non embryogènes, cultivés en milieux solides, ont été mis en suspension (pendant 5 h) en présence de la colchicine (5 h.a 30°C), du Tris(HCI ou du froid afin de détacher le réseau extracellulaire dans le milieu. Après analyse en 2D PAGE, les 2 polypeptides de 31.6 KDa ont été retrouvés dans les conditions embryogènes mais non dans les conditions non-embryogènes. Les traitements ne sont pas létaux puisque les cals ayant subi ces traitements ont repris leur croissance après rinçages et transfert sur le milieu solide embryogènes. Ces résultats suggèrent une relation étroite entre ces protéines. Le réseau extracellulaire et le Cytosquette. De toute évidence, leur présence dans les conditions embryogènes est en relation ave les compétences embryogènes chez le citrus.