Analyse de Glucuronides par chromatographie en phase liquide après dérivation au moyen de la bromométhyl-4méthoxy-7-coumarine : Application à l'étude de la glucuronoconjugaison in vitro de diverses aglycones terpéniques et stéroïdiques

Abstract

Les méthodes analytiques de dosages de glucuronides se classent en deux groupes : - les méthodes indirectes reposant soit sur la quantification de l’aglycone libérée par hydrolyse du glucuronoconjugué, soit sur une mesure de la conjugaison au moyen d’autres réactions enzymatiques (méthode de Mulder et Van Doorn) ; - les méthodes directes s’intéressant aux glucuronides en l’état. C’est surtout l’analyse chromatographique qui a été développée dans ce but. Afin de remédier au manque de spécificité des méthodes indirectes et d’accroître le niveau de sensibilité et le caractère généralisable des méthodes directes préexistantes, une technique de chromatographie liquide haute performance (CLHP) comportant une étape de dérivation a été élaborée. Il s’agit d’une réaction d’estérification du groupe carboxyle commun à tous les glucuronides réalisé avant l’étape chromatographique et utilisant la bromométhyl-4 méthoxy-7 coumarine comme réactif. Ce dernier apporte aux glucuronides un chromophore assurant une détection spectrophotométrique U.V. à la fois sélective et sensible. Le développement analytique de la méthode a porté sur les points suivants : - optimisation des paramètres de la réaction ; - recherche de systèmes chromatographie appropriés à la séparation des esters de glucuronides d’une part entre eux, et d’autre part, de l’excès de réactif. Pour ce faire, deux modes chromatographiques ont été utilisés, l’un en phase normale, l’autre en polarité de phases inversée. Ces systèmes permettent d’analyser les deux classes d’aglycones glucuronoconjuguées étudiées : à structure terpénique (menthol, bornéol) et stéroïdique (testostérone, estrones, androstérone) ; - identification des produits de la réaction d’estérification par spectrométrie de masse utilisant une fragmentation par ionisation chimique ; - isolement des glucuronides à partir de préparations microsomales. Des techniques d’extraction liquide/liquide et liquide/solide ont été élaborées. L’application de cette méthode analytique à l’étude biochimique de la glucuronoconjugugaison in vitro comprend : - la mesure des paramètres cinétiques de l’UDP-glucuronosyltransférase (E.C.2.4.4.17) sur des préparations microsomales de foie de rats ayant subi ou non un traitement sur phénobarbital ; - des déterminations d’activité sur des préparations microsomales de foie humain. La sensibilité de la méthode employée a permis de mesurer des niveaux d’activité aussi faibles que 0.02 nmol./min/mg de protéines dans le cas de la testostérone. - La mise en évidence de deux familles de rats Wistar vis-à-vis de la vitesse de conjugaison de l’androstérone. En conclusion, la technique de dérivation des glucuronides couplée à une analyse par CLHP présente les qualités requises pour une méthode directe et générale de dosage de ces métabolites. En effet, celle-ci est applicable à une grande d’aglycones hydroxylées glucuronoconjuguées.