Approche moléculaire des interactions phospholipides-D-3-hydroxybutyrate déshydrogénase de mitochondries de foie de rat par synthèse et emploi de nouveaux analogues de phospholipides

Abstract

La D-3-hydroxybutyrate déshydrogénase (BDH) mitochondriale est l’enzyme d’interconversion des corps cétoniques D-3-hydroxybutyrate et acétoacétate. Son site catalytique est localisé sur la face interne la membrane interne mitochondriale. Son activité nécessite la présence des lécithines, les autres phospholipides non réactivateurs augmentent l’efficacité de réactivation de l’enzyme. L’objectif de ce travail a été d’apporter des arguments expérimentaux révélateurs du rôle des différents groupements des têtes polaires des phospholipides dans le mécanisme de réactivation, de préciser les sites d’interactions de l’apoBDH avec les phospholipides et d’évaluer le degré d’insertion de l’enzyme dans la bicouche lipidique. Nous avons réalisé ce travail en utilisant différentes approches selon le schéma suivant : (1) Purification de l’apoBDH et des phospholipides de mitochondries de foie de rat. (2) Synthétiser de nouveaux phospholipides chimiquement définis, analogues de lipides bioactifs ; phospholipides fluorescents ou doublement marqués photoactivables et fluorescents. (3) Etude des conséquences des différents analogues de phospholipides synthétiques sur le processus de réactivation de la BDH comparé au système de référence à savoir les phospholipides mitochondriaux par mesure d’activités enzymatiques. (4) Caractérisation des sites d’interaction de la BDH avec les phospholipides par l’emploi de la technique de fluorescence (intensité, quenching, et transfert d’énergie) (5) Précision du niveau d’insertion de l’enzyme dans la membrane par photomarquage suivi d’électrophorèse. Les résultats obtenus ont permis de dégager de nouvelles avancées : - Les charges positives des lécithines sont indispensables à l’activité. Les groupements méthyles jouent aussi un rôle essentiel dans la réactivation de l’enzyme. La dispersion des charges positives à la surface de liposomes permet d’augmenter l’efficacité d la réactivation de la BDH. - La BDH interagit à la fois avec les têtes polaires et les chaînes d’acide gras des phospholipides. Elle se situe en majeure partie à proximité de la tête polaire avec au moins un segment (probablement transmembranaire) localisé dans la phase phospholipidique hydrophobe.