Hétérogénéité structurale et fonctionnelle de la 5'-nucléotidase

Abstract

La 5’-Nucléotidase du cytosol de foie de boeuf a été purifiée à l’homogénéité par une double chromatographie d’affinité sur concanavaline A Sepharose, puis 5’AMP sepharose. Nous avons ainsi obtenu une préparation hautement purifiée (12 000 fois). L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en milieu SDS révèle deux bandes de masse moléculaire de 65 000 et 57 000 daltons respectivement. Ces valeurs diffèrent de celle de la sous-unité de l’isoenzyme membranaire (70 kDa). L’enzyme purifié hydrolyse spécifiquement les 5’-mononucléotides et le 5’-CMP serait son meilleur substrat. Cependant, l’affinité de la 5’-nucléotidase cytoplasmique pour les différents mononucléotides est faible comparativement à l’enzyme membranaire. De plus, si les nuclésides di et triphosphates, constituent de puissants inhibiteurs compétitifs de la 5’-nucléotidase membranaire, ces différents substrats sont activateurs de l’enzyme cytoplasmique. D’autre part, la 5’-nucléotidase cytoplasmique nécessite l’apport de cations divalents exogènes pour son fonctionnement. Son activité maximale intervient à pH 7,5 et 9,5. Par contre, l’isoenzyme membranaire ne possède qu’un seul pH optimum à 7,5. L’étude des interactions des diverses lectines avec le glycanne de l’enzyme cytoplasmique, prouve sa nature glycoprotéique et suggère une structure glycannique différente de l’isoenzyme membranaire. Par contre, les anticorps produits contre la 5’-nucléotidase membranaire reconnaissent et inhibent l’enzyme du cytosol. Cette réactivité croisée démontre l’existence d’épitopes communs proches du site catalytique. Par ailleurs, nous avons réalisé une étude de l’effet de la phospholipase C spécifique du phosphatidyl-inositol (PI-PLC) sur l’attachement de la 5’-nucléotidase à la membrane plasmique. Nous avons pu mettre en évidence que seule une fiable proportion de la molécule est convertie en une forme soluble par ce traitement. De plus, il a été noté une grande variation de sensibilité à l’action de la PI-PLC entre la 5’-nucléotidase et la phosphatase alcaline, dépendante du type cellulaire et de l’espèce étudiée. Les différences de pourcentage de solubilisation des deux enzymes par la PI-PLC pourraient être dues à des raisons d’ordre stérique liées à la topographie des protéines dans la membrane plasmique, soit à un plymorphisme d’ancrage de ces protéines dans la membrane.