Rôle des phospholipides dans la structure et la fonction de la D-β-hydroxybutyrate déshydrogénase de la membrane interne mitochondriale

Abstract

La D-β-hydroxybutyrate déshydrogénase (BDH) est une protéine amphipatique localisée dans la membrane interne mitochondriale. Son activité catalytique nécessite la présence de lécithines comme seule classe de phospholipides réactivateurs. Les autres phospholipides de la membrane ne sont pas réactivateurs, cependant leur présence renforce le niveau d’activité et l’efficacité de réactivation de la BDH par les lécithines. Dans ce travail, nous avons utilisé la BDH comme un des modèles permettant l’étude des interactions entre les protéines membranaires et les phospholipides. Après purification de l’apoenzyme catalytiquement non actif et des phospholipides, le développement de cette étude a été conduit autour des points suivants : 1) recherche de résidus aminoacyl essentiels à l’activité et de leur localisation par rapport aux zones d’interaction de la BDH avec les phospholipides ; 2) étude du rôle des phospholipides dans les relations structure-fonction de la BDH ; et 3) mise en évidence du niveau d’interaction de la BDH avec les phospholipides. Différentes méthodologies d’approche ont été utilisées : modifications chimiques contrôlées, étude cinétique de la réactivation de la BDH par les phospholipides, fluorescence extrinsèque et intrinsèque, et photoillumination de la phospholipides synthétiques porteurs d’une sonde photoactivable. L’ensemble des résultats obtenus par ces différentes techniques a permis d’aboutir aux principales conclusions suivantes : - Un résidu arginyl, essentiel à l’activité, est localisé dans le site de fixation du substrat. Un résidu aminoacyl acide (asp ou glu), essentiel à l’activité, est localisé dans/ou près du centre actif. Au moins deux résidus tyrosyl sont présents hors du site de fixation des ligands du centre actif mais nécessaire à l’activité BDH ; un résidu serait situé dans/ou près des zones d’interactions de la BDH avec les phospholipides alors qu’un second résidu serait localisé dans une région hydrophile. - Le centre actif de l’enzyme est localisé près de l’interface eau-phospholipides. - L’activité de la BDH, phospholipide dépendante, est due à au moins deux facteurs essentiels : 1) changement de conformation, discret mais essentiel de la chaîne polypeptidique, induit par les phospholipides ; 2) rôle cofacteur de lécithines dans le processus catalytique. - L’apoBDH interagit directement avec les chaînes hydrophobes des phospholipides. La surface polypeptidique en interaction est plus importante dans la zone hydrophobe située près de la tête polaire que celle qui pénètre au niveau de la séparation des deux feuilles phospholipidiques.