Préparation de dérivés fluorscents en vue de l'analyse du thromboxane B₂ par chromatographie liquide haute performance ou par immunodasage

Abstract

L’objectif du travail a été une étude de l’intérêt potentiel d’un dosage du métabolite de l’acide arachidonique, le Thromboxane B₂ à l’aide de méthodes spectroscopiques : la chromatographie liquide haute performance couplée à une détection par fluorescence et la polarisation de fluorescence. Le dosage de arachidonique régulent les propriétés fonctionnelles des plaquettes de l’acide arachidonique régulent les propriétés fonctionnelles des plaquettes sanguines. La première partie de ce mémoire est consacrée à des rappels portant sur les méthodes de dosage en biologie clinique, l’origine et le rôle biologique du TXB₂, le principales techniques permettant actuellement son analyse, ainsi que des rappels théoriques sur les principes de la fluorescence et de la polarisation de fluorescence. La deuxième partie traite de la synthèse chimique d’un dérivé des coumarines se fixant sur les fonctions alcool du Thromboxane. D’autre part, deux sondes fluorescentes se liant à la fonction carboxyle ont été utilisées. La dérivation du TXB₂ par ces trois sondes a nécessité : 1) la détermination des rendements d’estérification de la fonction carboxyle en prenant comme modèle l’acide palmitique ; 2) la recherche des systèmes chromatographiques appropriés à séparer les esters de l’excès de réactif ; 3) l’optimisation des paramètres des réactions de dérivation (température, temps, excès de réactifs, solvants). Les systèmes chromatographiques permettent l’obtention des dérivés sans risque de dégradation et avec une bonne pureté vérifiée par l’absence de TXB₂ libre et d’excès de sonde dans les fractions récupérées. Dans la troisième partie, nous avons, dans un premier temps, utilisé les dérivés fluorescents du TXB₂ en vue d’une détection en fluorescence couplée à la CLHP pour un dosage du TXB₂ libéré in vitro par des plaquettes activées. Par ailleurs, dans le but de mettre au point un dosage du TXB₂par polarisation de fluorescence, les caractéristiques spectroscopiques des dérivés, leur stabilité, leur immunoréactivité et les quantités minimales détectables en fluorescence et polarisation de fluorescence ont été étudiées. Les deux techniques pourraient être utilisées pour un dosage plasmatique de TXB₂ sous deux réserves : amélioration du rendement de la dérivation de faibles quantités de TXB₂ d’origine biologique dans le cas de la CLP couplée à la détection par fluorescence et augmentation de la sensibilité des appareillages dans le cas de la polarisation de fluorescence.