Nucléotide cyclique phosphodiestérase du cerveau de rat : Purification et caractérisation d’une isoforme inhibée sélectivement par le nouvel antidépresseur Rolipram

Abstract

Dans le SNC, l’AMPc est le second messager de nombreux neurotransmetteurs, modulant certains types de transmissions synaptiques. Le Rolipram est un nouvel antidépresseur, au mécanisme d’action original, attribué à l’inhibition de l’AMPc phosphodiestérase cérébrale. Cette enzyme, responsable d la dégradation des nucléotides cycliques, est un système complexe d’isoenzymes multiples. Notre travail a été centré sur la caractérisation biochimique et pharmacobiochimique d’une isoenzyme cérébrale sensible au Rolipram, chez le rat. Après fractionnement des différentes isoenzymes du cytosol cérébral par isoélectrofocalisation, nous avons mis en évidence l’inhibition puissante et sélective d’une forme de pI 5,6 par Rolipram. Cette isoenzyme est indépendante de la calmoduline, hydrolyse spécifiquement l’AMPc, et présente une cinétique non michalëlienne, à coopérativité négative. Cette isoenzyme a ensuite été purifiée à partir du cytosol par chromatographie d’affinité sur un analogue du Rolipram immobilisé. L’enzyme purifiée présente deux pI : 6,7 et 4,8. Ces deux isomères de charge, de sensibilité au Rolipram identique, et de cinétiques michaëliennes similaires, semblent correspondre à deux états d’agrégation d’une même protéine. Les PM correspondants ont été trouvés, par différentes techniques, proches de 42 et 89 KD. Des conditions permettent la stabilisation de l’enzyme ont été mises au point. Une isoenzyme sensible au Rolipram a également été purifiée à partir de la fraction membranaire solubilisée, par chromatographie d’affinité sur Rolipram immobilisé. Par ailleurs, le pouvoir inhibiteur de divers analogues du Rolipram sur la phosphodiestérase cérébrale a été étudié, ce qui a permis de définir les éléments structuraux favorables à l’inhibition. Des composés inhibiteurs puissants et sélectifs de la forme de pI 5,6 , et donc susceptibles de présenter un intérêt pharmacologique, ont été mis en évidence.