Contribution à l'étude du métabolisme azoté chez le champignon ascomycète sphaerostible repens: purification, propriétés physico-chimiques et étude immunologique des deux isoformes de l'aspartate aminotransférase

Abstract

L'aspartate aminotransférase (AAT) catalyse la réaction réversible suivante: asparate + α – cétoglutarate → glutamate + oxaloacétate chez le champignon ascomycète Sphaerpstilbe repens, et par l'utilisation de deux techniques différentes: chromatographie sur DEAE – Séphacel et électrophorèse sur gel de polyacrylamide, nous avons montré que l'aspartate aminotransférase est constituée de deux isoformes appelées respectivement AAT1 et AAT2. L'AAT1 est localisée dans la matrice mitochondriale, alors que l'AAT2 est cytosolique. L'enzyme mitochondriale a été purifiée 247 fois avec une activité spécifique de 644nkat/mg de protéine. L'isoforme cytosolique est obtenue pure à l'homogénéité électrophorètique avce un rendement de près de 47% et une activité spécifique de 644 nkat/ mg de protéines. Les propriétés physico-chimiques des deux isoformes ont été étudiées. Une différence très nette apparaît entre l'AAT et l'AAT Concernant la masse molaire et la composition en sous-unités: l'isoforme mitochondriale est tétramique kDa et constituée de deux sous-unités. Les deux isoformes diffèrent également par leurs constantes d'affinités pour les substrats et par leur stabilité thermique. Une étude immunologique des deux isoformes a été effectuée. Il en sort clairement que les anticorps dirigés contre l'AAT ne reconnaissent par l'AAT et inversement. La séparation d'un même thalle en trois parties: mycélium végétatif, corémies et rhizomorphes, a montré que l'activité enzymatique est importante dans le mycélium végétatif des thalles jeunes. L'activité devient par la suite prépondérante dans les rhizomorphes en raison de leur développement important. Le transfert de Sphaerostilbe repens sur différentes sources d'azote nous a permis de montrer clairement que la nature de la source azotée a une influence sur la morphologie du champignon et sur l'activité des enzymes directement impliquées dans l'assimilation de l'ammonium. Par l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de l'ammonium chez Sphaerostilbe repens. La présence de la GS est certaine, mais son activité est très réduite. Le glutamate serait alors repris par les aminotransférases en particulier l'aspartate aminotransférase et l'alanine aminotransférase.