Préparation et caractéristiques d'une γ - D-glutamyl-(L)meso-diaminopimelate endopeptidase ( Endopeptidase I ) de bacillus sphaericus

Abstract

L’endopeptidase I hydrolyse la liaison γ-D-glutamyl-meso-diaminopimélate des substrats dérivés du peptidoglycane : X-L-Al-γ-D-Glu-(L)ms-A₂pm(L)-D-Ala. Le procédé de purification et une caractérisation partielle de la protéine ont été publiés, le rendement à partir du milieu de sporulation était faible (7,5 µg/l). Nous l’avons amélioré en utilisant une culture industrielle de 1100 I de B.sphaericus, et en mettant au point une méthode de désorption de l’enzyme à partir des spores qui sont broyées en présence de billes de verre et traitées successivement par le lysozyme et NaCl 2M. La purification a été menée en parallèle avec les deux sources d’enzymes : milieu de sporulation et spores. On a obtenu respectivement 3,4 et 10,3 mg d’enzyme. La similitude des caractéristiques : Mr 45 000, pl 5,4, Km 0,57 et 0,8mM, Vm 8,3 et 14,3 µmoles.min⁻¹.mg⁻¹, démontre leur identité. Il reste une quantité importante d’endopeptidase I dans les résidus de spores, après la désorption exposée ci-dessus. Sur ces résidus nous avons entrepris une méthode de désorption par les détergents, après avoir démontré que ceux-ci, qu’ils soient anioniques, cationiques, diioniques ou non ioniques étaient activateurs de l’enzyme. Aucun d’entre eux cependant ne conduit à une production significative d’endopeptidase I. L’endopeptidase I est une métalloenzyme ; nous avons démontré, par étude de l’émission de rayons X induite par un faisceau de protons, qu’elle possède 2 ions Zn²⁺ par molécule. L’un d’eux est cofacteur de l’enzyme. Le potassium à raison de 10 atomes par atome de zinc est également présent. Une séquence N-terminale de 23 amino-acides et 3 séquences internes de 21,12 et 9 amino-acides ont été déterminées après protéolyse par la papaîne. Ces séquences devraient permettre la construction de sondes oligonucléotidiques pour le clonage du gène de l’enzyme en vue de son séquençage et sa surexpression.