Contribution à l'étude des relations structure-fonction des récepteurs de la famille vasopressine/ocytocine : Mise au point d'outils pour leur purification et leur caractérisation

Abstract

Ce travail a pour objectif d’étudier le site de liaison des antagonistes du récepteur V1a humain de la vasopressine. Nous avons cartographié la zone d’interaction d’un antagoniste cyclique avec le récepteur V1a de façon directe par la technique de marquage par photoaffinité. Nous avons développé et caractérisé pharmacologiquement et fonctionnement un analogue photoactivable de la vasopressine : le 125I ZOTA. Les récepteurs V1a exprimés dans les cellules CHO sont photomarqués de façon spécifique par ce ligand et sont observés sur gel SDS-polyacrylamide sous la forme de deux protéines glycosylées radioactives de 85-90 kDa et 46 kDa. Celle de 46 kDa résulte du clivage de la protéine de 85-90 kDa par une protéase présente dans la préparation membranaire des cellules. Afin de délimiter les zones de contact entre le récepteur et son ligand, l’espèce protéine de 46 kDa photomarquée par le 125I ZOTA a été fragmentée chimiquement (bromure de cyanogène) et/ou enzymatiquement (protéase Lys-C et Arg-C). En compilant les résultats de fragmentation simple où double on peut limiter la zone de marquage à trois résidus Val126-Val127-Lys128 dans la partie supérieur du domaine transmembranaire III. Ces résultats ont été confirmés par des expériences de mutagenèses sur le site d’ancrage du récepteur V1a. Le ZOTA se fixe de façon équivalente sur le récepteur OT, en effet la liaison covalente s’est effectuée sur le tripeptide : Leu 114-Val115-Lys116 situé sur TMD III. Nous avons mis au point une méthode de purification du récepteur V1a étiquetté 6xHis par incubation avec des billes magnétiques porteuses du complexe Ni-NTA. L’analyse part spectrométrie de masse du récepteur purifié a révélé la présence deux fragments peptidiques de masse m/z = 1107,9 et 1127,9 appartenant au récepteur V1a.