Mécanismes moléculaires de la phagocytose des mycobactéries et de l'inhibition post-phagocytose de la maturation des phagosomes et de la présentation d'antigène chez les macrophages humains - Sendide, Khalid (Université Sidi Mohamed Ben Abdellah, Faculté des Sciences Dhar Mahraz, Fès, 2005)
Le pathogène Mycobacterium tuberculosis atténue l’expression de surface des molécules CMH classe II en réponse à l’IFN-y. Dans cette étude, nous avons examiné si l’alcalinisation intracellulaire causée par l’uréase mycobactérienne pourrait être impliqué dans le transite défectueux des molécules classe II. La phagocytose de souche de BGC sauvage était associée à une sécrétion intracellulaire d’ammonium, laquelle sécrétion augmentait de façon substantielle quand l’urée était ajoutée au milieu de culture cellulaire. Cette augmentation de la sécrétion intracellulaire d’ammonium, par dégradation d’urée, corrélait avec une inhibition de l’expression de surface des molécules classe II. A l’opposé, aucune sécrétion d’ammonium n’était détectée chez les cellules infectées par une souche mutante de BCG défectueuse dans l’expression d’uréase active. Parallèlement, cette souche avait un effet moindre sur l’inhibition de l’expression de surface des molécules classe II était établie par des expériences où la phagocytose de billes de latex enrobées d’uréase ont montré une augmentation de l’ammonium intracellulaire et une diminution de l’expression de surface des molécules classe II en réponse à l’IFN-y. Comme continuité de ces résultats, nous avons examiné la nature des molécules classe II qui atteint la surface des cellules. Le marquage intracellulaire avec des anticorps spécifiques capables de discriminer entre les populations de molécules classe II matures et immatures a mis en évidence une prédominance des molécules classe II encore associées à la chaîne invariante Ii chez les cellules infectées. Ces résultats suggèrent que les mycobactéries inhibent de façon spécifique l’export des molécules classe II matures. Dans le même sens, nous avons démontré que BCG inhibe l’expression de la cathépsine S (CatS) en réponse à l’IFN-y et cause une augmentation du fragment p10 de la chaîne Ii, considéré comme substrat de la CatS. D’un autre coté, nous avons montré que M.bovis BCG exploite l’induction cytokine IL-10 pour inhiber l’édition des molécules classe II chez les macrophages humains, ce qui aboutirait probablement à une inhibition de molécules classe II chargées de peptides et de ce fait, une moindre présentation de peptide mycobactériens aux cellules T CD4+. Cette habilité pourrait en effet présenter une stratégie que les mycobactéries pathogènes utilisent pour contourner la surveillance immunitaire et persister ainsi au sein de l’hôte. D’un autre coté, et dans le but de faciliter les études des mécanismes de maturation des phagosomes chez les cellules infectées par les organismes pathogènes intracellulaires, nous avons développé une nouvelle technique basée sur la cytométrie en flux et le marquage spécifique de composantes de phagosomes et lysosomes. L’analyse par cytométrie en flux de phagosomes partiellement purifiés et marqués avec des anticorps spécifiques a montré une acquisition progressive des marqueurs Rab7 et LAMP-1, ce qui était consistent avec le mouvement des vésicules le long de la voie endocytique. Comme application de cette technique, nous avons pu montrer que l’internalisation simultanée de billes de latex avec des lysats de Mycobacterium tuberculosis causait une diminution remarquable de l’acquisition de Rab7 et LAM-1 par les phagosomes, en même temps qu’une inhibition de la fusion des vésicules avec les lysosomes chargés de FITC-Dextrane. L’inhibition de la fusion entre phagosomes et lysosomes pouvait être attribuée, au moins en partie, au glycolipide de la paroi cellulaire : le lipoarabinomannan ; et des analyses postérieurs a montré que le traitement des cellules par la VitD3 avant exposition lipoarabinomannan au rétablissait totalement la maturation des phagosomes. Cette action de la VitD3 était abrogée par le LY-294002, suggèrent donc une implication d’une voie de signalisation qui dépend de la phosphoinositide 3-kinase. Ces résultats nous ont permis d’établir une technologie à plateforme robuste basée sur le marquage de membrane de cellules phagocytaires et sur la cytométrie en flux, très applicable à large spectre dans l’identification de composantes microbiennes et autres molécules biologiquement actives qui influencent la biologie des phagosomes. Dans une autre partie de ce travail, nous avons utilisé la lignée cellulaire de monocytes humains THP-1 et les cellules fibroblastiques d’ovaire d’Hamster chinois (CHO) afin d’examiner la phagocytose de Mycobacterium bovis BCG. La cytométrie en flux était combinée à des approches moléculaires et biochimiques pour démontrer un mécanisme d’internalisation de BCG faisant intervenir le récepteur CD14 seul ou une voie d’internalisation CR3 dépendante positivement régulée par CD14. La phagocytose par les cellules CD14 positives était atténuée par les inhibiteurs de la PI3K kinase LY-249004 et wortmanin. Dans le même sens, des expériences avec des cellules CHO exprimant CD14 et CR3 suggèrent que les bactéries se lient au CD14 puis utilisent le TLRl2 pour initialiser une voie de signalisation dépendante de la PI3K. Des expériences additionnelles avec des anticorps bloquants ont montré que les anticorps anti-TRL2 inhibent la phagocytose du BCG par les cellules THP-1. de plus, le blocage de l’expression de la cytohésime-1, qui est une mélocule adaptatrice dans l’activation de la β2-integrine régulée par la PI3K, inhibe de façon spécifique l’ingestion des BCG CR3 dépendante régulée par la CD14. Ceci était consistant avec d’autres résultats où nous avons montré une association physique entre la cytohésine-1 et la CR3 chez les cellules stimulées avec des composantes mycobactériennes de surface. L’ensemble de ces résultats révèle avec des composantes mycobactéries orientent leur internalisation à travers un processus de signalisation « inside-out » impliquant CD14, TLR2, PI3K et cytohésines-1. Ceci convertit le récepteur CR3 à faible avidité en un récepteur actif, ce qui conduit à une internalisation accrue des bactéries. Finalement, nous reportons dans ce travail que M. bovis BCG secrète des protéines qui sont induites au sein des macrophages infectés. Nous avons par la suite pu établir q’une protéine mycobactérienne interagit avec TACO, qui est une protéine retenue dans les phagosomes renfermant des mycobactéries pathogènes. Cette protéine, que nous avons désigné CIP55, pouvait être précipitée par la GST-TACO à partir de microphages de souris infectés par BCG. Cette interaction semble être modulée par le cholestérol et implique la région N-terminale de TACO.
Keywords: Biologie moléculaire; Immunologie; Mycobactérium tuberculosis; BCG; Macrophage; CMH classe II; Cytométrie en flux; Phagocytose; Récepteur de surface; Signalisation cellulaire et TACO protéine