Stratégies utilisées dans le diagnostic biochimique et génotypique de la mucoviscidose : Fibrose kystique du pancréas - Alif, Najat (Université de Nancy I, Nancy, 1989)
Une première partie de ce travail consiste à mettre au point une méthode reproductible pour le dosage de trois activités enzymatiques : la γ glutamyl transpeptidase, la leucine aminopeptidase, la phosphatase alcaline dans les liquides amniotiques prélevés à 16, 17, 18 et 19 semaines de gestation. Pour la phosphatase alcaline, l’informativité du dosage est sensibilisée en évaluant plus spécifiquement l’activité de la phosphatase alcaline intestinale grâce à l’utilisation d’inhibiteurs plus ou moins spécifiques, tels que la L-phénylalanine, L-homoarginine, ou/et le brotétramisol. Les valeurs de références ont été établies sur près de 100 liquides amniotiques et le calcul statistique des 1er, 5ème, 95ème et 99ème percentile a été réalisé afin d’affecter, aux valeurs trouvées en dehors de ces zones, une significations statistiquement valable. La deuxième partie de ce travail concerne la mise au point des techniques d’hybridation en utilisant des sondes d’ADN après Southern Blotting. Il s’agit des sondes A37, KM19 et XV-2 dont les locus sont situés près du gène responsables de la mucoviscidose. Ces sondes ont été amplifiées dans des plasmides et isolées en quantité suffisante pour réaliser les réactions d’hybridation. Les sondes marquées à la biotine ou ai phosphore 32 sont hybridées avec des échantillons d’ADN humain extrait, soit à partir de leucocytes, soit à partir de prélèvement de villosités choriales et digérés avec des enzymes de restriction appropriées. L’hybridation se fait après Southern Blotting sur filtre de nitrocellulose et la révélation est effectuée, soit par coloration, soit par autoradiographie selon qu’il s’agisse d’une sonde froide ou radioactive.
Keywords: Biochimie appliquée; Mucoviscidose; Dosage biochimique; ADN; Enzyme de restriction; Southern blotting; Sonde d'ADN; Hybridation; RFLP; Déséquilibre de liaison