Contribution à l'étude du métabolisme des cobalamines et purification d'une protéine axtramembranaire de liaison de la vitamine B12

Abstract

L’anémie pernicieuse est une maladie auto-immune caractérise par une déficience en cobalamine, par une anémie mégaloblastique, une neuropathie et une gastrite auto-immune avec des anticorps anti-facteur intrinsèque. Ces anticorps bloquent le site de liaison du facteur intrinsèque qui est une protéine essentielle pour l’assimilation des cobalamines. Ce travail consiste à identifier dans un premier temps le domaine épitopique des anticorps anti-FI de type 1. Cette étude fait appel à trois approches complémentaires : • Approche 1 : analyse comparative de la séquence en acides aminés déduite de l’ADNc par la méthode des « clusters hydrophobes ». 4 domaines ont été retenus comme candidats potentiels nommés : IF R5, IF R6, IF R7 et IF R8. • Approche 2 : pontage covalent de la vitamine B12 marquée avec le facteur intrinsèque et « peptide mapping » des produits d’hydrolyse, séquençage des peptides associés à la vitamine B12 après purification par HPLC. Cette approche a permis de montrer que la proline est un résidu proche du site de pontage de la vitamine B12 et que le domaine IF R7 est proche du site de pontage. • Approche 3 : différentes séries de peptides dérivées de la séquence du FI ont été synthétisées et testées par dosages ELISA, RIA, gel filtration, SDS-PAGe, autoradiation… L’un de ces peptides, nommé IF R7 (séquence 251-265 du FI), a inhibé l’activité bloquante des anticorps anti-FI de type 1 in vitro avec une constante d’inhibition de 2.3 µM. Les acides aminés Ser²⁵⁶, Lys²⁶² et Val²⁶⁵ du peptide IF R7 sont essentiels pour la reconnaissance de l’épitope. • La liaison covalente du peptide IF R7 aux βglobulines a produit des Ac anti-FI de type 1 Chez le mouton immunisé. In vivo, le test de Schilling fait sur le mouton a révélé les mêmes résultats. L’identification de cet épitope a permis donc de définir un modèle animal expérimental de l’auto-immunité anti-FI afin d’étudier la pathologie de l’anémie pernicieuse. • Dans un deuxième temps, nous avons purifié par chromatographie d’affinité une protéine obtenue par digestion de la muqueuse iléale de porc par la papaïne, avec un facteur de purification de 17300, un rendement de 63% et une activité de liaison de 11260 pmoles/mg de protéines. La masse moléculaire de cette protéine est de 69 kDa en SDS-PAGE et son point isoélectrique de 5.1. "La papaïne α" a une activité de liaison aussi bien pour la cobalamine libre que pour le complexe FI-Cbl en autodiagraphie native-PAGE. Cette protéine pourrait correspondre au domaine extracellulaire du récepteur iléal du facteur intrinsèque.