Etude des comportements amphiphiles de l’acétylcholinestérase du cerveau de rat et évaluation des effets des organophosphorés In Vitro et in vivo

Abstract

L’acétylcholinestérase (AChE) est une enzyme clef du fonctionnement de la synapse cholinergique où elle hydrolyse rapidement l’acétylcholine. Le présent travail a pour but de caractériser les formes de l’AChE du cerveau de rat sur le plan fonctionnel et structurel. Nous avons mis au point une nouvelle méthode de séparation des isomères en taille de l’AChE, par l’élution d’un gel d’affinité avec un gradient de tétraméthylammonium (TMA). La fraction soluble dans un tampon salin (Ache-SS) et la fraction nécessitant du détergent pour sa solubilisation (AChE-SD) ont été purifiées à homogénéité. L’élimination du détergent entraine une autoagrégation et une dénaturation partielle de ces formes. Il est possible de lier les différentes formes à des liposomes artificiels par une interaction à prédominance hydrophobe. L’électrophorése de l’AChE marquée par du3-(trifluorométhyl)-3-(m-(125 I)-iodophényl) diazirine (125 I-TID), un marqueur de domaine hydrophobe, montre une bande radioactive à 70 KD après traitement par la protéinase K de l’AChE marquée par le 125 I-TID, la radioactivité est retrouvée à proximité du front du gel, avec une masse apparente inférieure ou égale à 3KD. Nous avons proposé une structure tétramérique compatible avec nos observations pour l’AChe-SD. L’extrémité C-terminale de deux sous-unités catalytiques sert à l’ancrage dans les membranes. Cette structure diffère de celle proposée pour l’AChE du noyau caudé de cerveau humain ou bovin où une sous-unité catalytique, sert à l’ancrage dans les membranes. Il est possible que le modèle de l’ancrage par la sous-unité de 20KD ne soit pas universel. Cette approche plus ‘’structurelle’’ a été complétée par une étude sur les effets des organophosphorés sur l’AChE. Nous avons entrepris d’étudier au niveau biochimique, les différentes étapes de l’intoxication de l’AChE par des organophosphorés, afin d’en dégager éventuellement des méthodes de protection. Cette étude a été effectuée sur le rat et la souris à deux niveaux : 1-in vitro : les résultats ont montré : a-l’activité de l’AChE est bloquée par les Quinalphos b-des protéines du plasma et en particulier la BuChE constitue une première barrière contre l’intoxication par le Quinalphos c-la foie et le cerveau contiennent d’une part des structures (microsome) qui en activant le Quinalphos le rendent plus toxique et d’autre part une fraction soluble (cytosol) qui inactive l’insecticide. Les principes actifs responsables de ces effets sont respectivement les enzymes des cytochromes P450 et la glutathion-S-transférase (GST). d-il est possible de protéger in vitro l’AChE contre l’intoxication par le Cimétidine qui bloque l’activation du Quinalphos et addition de glutathion et de GST qui bloquent le Quinalphos activé. 2-in vivo : nous avons étudié les effets protecteurs des composés potentiels qui peuvent soit modifier le métabolisme du Quinalphos soit agir comme balayeur de l’insecticide. Aucun des moyens de protection préconisés ci-dessus ne fonctionne à doses toxiques très élevées de Quinalphos. Un résultat paradoxal cependant, le glutathion qui normalement protège in vitro potentialise la toxicité du Quinalphos in vivo, probablement parce qu’il accroit la perméabilité du Quinalphos vers le cerveau.