Développement d'outils et investigations génétiques chez clostridium acétobutylicum

Abstract

Le travail présenté dans cette thèse a pour objectif d’améliorer nos connaissances des propriétés génétiques de Clostridium acetobutylicum, dans le but d’utiliser cet organisme à des fins biotechnologiques. Trois vecteurs navettes (pKNT15, pKNT18 et pKNT19) ont été construits en utilisant le plasmide pIM13 (2,2 Kb, Emr) Comme réplicon de plasmides se répliquent à la fois chez Clostridium acetobutylicum, Basillus subtilis et Escherichia coli. L’étude de leur stabilité a montré une acetobutylicum. Cet obstacle a pu être levé en sélectionnant une souche (NI-4082) chez laquelle ces plasmides recombinants sont maintenus de manière stable pendant plus de 100 générations. Deux systèmes de restriction-modification de type II ont été mis en évidence et a caractérisés dans deux souches différentes de Clostridium acetobutylicum. Il s’agit d’une part de l’enzyme de restriction CacI isolé de la souche NI-4081 qui est un isoschizomère de MboI reconnaissant et hydrolysant la séquence 5’-GATC-3’. Le système de modification correspondant qui consiste en la méthylation de l’adénine présente dans la séquence, est identique à l’action de la Dam-méthylase d’Escherichia coli. Le deuxième enzyme de restriction CacII a été identifié dans la souche ABKn8. Elle reconnaît et hydrolyse la séquence hexanucléotidique 5’-GCNGC-3’ en générant des bouts francs. On ne reconnaît, à l’heure actuelle, aucun isoschizomère de cette enzyme. Deux plasmides recombinants identiques (pCER100 et pCER101) obtenues indépendamment à partir d’une banque génomique de Clostridium acetobutylicum ABKn8, se sont révélés capables de restaurer, chez les souches RecA⁻ d’E. coli, la résistance au méthyl-méthane-sulfonate, à la mitomycine C ainsi qu’aux rayons UV. La séquence nucléotidique de l’insert de pCER100 a révélé la présence de trois phases ouvertes de lecture codant pour trois polypeptidse de masse moléculaire de 16, 21 et 23 kDa, similaires à celles déterminées dans un système de transcription-traduction in vitro. Les deux protéines (16 et 21 kDa) présentent une forte homologie entre elles et avec les produits des gènes de résistance au tellurium identifiés chez Alcaligenes sp. La protéine de 23 kDa, qui ne présente aucune homologie avec les différentes protéines RecA connues et séquences à ce jour, est vraisemblablement responsable de la complémentation partielle des mutations RecA d’E. coli.