Isolement, purification et caractérisation d'une glycoprotéine urinaire inhibant la cristallisation de l'oxalate de clacium in vitro

Abstract

La lithiase urinaire, maladie des sociétés d’abondance, est de plus en plus fréquente dans les pays industrialisés, surtout depuis la fin de la seconde guerre mondiale. Elle touche aujourd’hui près de 2 millions de personnes en France. Cette augmentation est due à l’accroissement de fréquence des calculs oxalo-calciques qui représentent près de 70 % des calculs observés dans ce pays. Il est admis actuellement, que cette pathologies lithiasique est multifactorielle. Des théories fondées sur des données physico-chimiques, tentent d’expliquer les mécanismes de la lithogenèse. Parmi ces théories, la théorie du déficit en inhibiteur a retenu notre attention. Selon cette théorie, les urines de sujets lithiasiques sont incapables d’empêcher ou de réduire la cristallisation de la même manière que les urines des sujets normaux à des degrés de sursaturation équivalents. Cela implique que les urines normales contiennent des substances capables d’empêcher la précipitation des solutés en sursaturation qui déficientes chez les lithiasiques. De multiples tentatives pour identifier la ou les substances responsables de l’activité d’inhibition de la cristallisation des urines ont abouti à des résultats controversés. La complexité du milieu urinaire et la variété des techniques utilisées pourraient expliquer la discordance de ces résultats. Parmi les substances incriminées dans l’inhibition de la cristallisation figurent les petits ions tels que la citrate, le pyrophosphate, le magnésium, le zinc ; des macromolécules comme la néphrocalcine (NC), la protéine de Tamm-Horsfall (THP), l’inter-alpha-trypsine inhibiteur, les acides ribonucléiques et les glycosaminoglycannes (GAGs) telles que les sulfates de chondroïtine et sulfate d’héparane. Dans notre laboratoire nous avons réalisé une tentative de purification et d’identification d’une substance inhibant la cristallisation. Auparavant, nous avons développé un modèle de cristallisation de l’oxalate de calcium in vitro pour tester les macromolécules purifiées à partir des urines. Dans cette étude, outre la NC et GAGs, nous avons réussi à isoler une glycoprotéine de poids moléculaire d’environ 35 000 Da dotée d’un pouvoir inhibiteur important vis-à-vis de la cristallisation de l’oxalate de calcium. Cette même protéine, isolée à partir des urines des sujets lithiasiques, montre une diminution d’inhibition de la cristallisation environ de moitié par rapport aux sujets témoins. Nous avons également observé que les GAGs fractionnés à partir de surines des patients de lithiase étaient moins efficaces pour inhiber la cristallisation comparativement aux GAGs fractionnés à partie des urines des sujets normaux. Notre étude démontre que les urines normales contiennent plusieurs substances macromoléculaires inhibitrices de la cristallisation de l’oxalate de calcium et qu’une seule macromolécule ne peut être seule responsable de l’activité inhibitrice de la cristallisation totale de l’urine. De plus, nous supposons que la diminution de l’inhibition de la cristallisation de l’oxalate de calcium chez les sujets lithiasiques n’est pas due uniquement à une diminution d’activité inhibitrice d’une seule macromolécule mais à une baisse d’activité affectant plusieurs molécules. Dans la deuxième partie de notre travail sont rapportés les résultats préliminaires obtenus dans la caractérisation de la protéine de 35 000 Da. Elle semble constituée de deux chaînes peptidiques de poids moléculaire d’environ 20 000 Da liées par des hydrates de carbone qui représentent 8,5 % environ du poids total de la molécule. Des tests enzymatiques et chimiques montrent que la chondroïtinase AC, l’hyaluronidase et l’O-Glycannase n’ont aucun effet sur l’activité inhibitrice de la cristallisation de la protéine de 35 000 Da. Cependant, cette activité disparaît après traitement par des protéinases. Il semble donc que l’activité inhibitrice de la protéine de 35 000 Da est supportée exclusivement par les chaînes peptidiques. A l’aide d’une technique de microséquençage et d’immunodiffusion, nous avons montré que cette protéine a une homologie structurale avec la famille des inter-alpha-trypsine inhibiteurs et de l’alpha-1-microglobuline. Les résultats obtenus dans cette partie nous ont permis de déterminer quelques caractéristiques de la protéine de 35 000 Da. Ces caractéristiques permettront d’orienter les recherches futures sur la structure complète de cet inhibiteur aussi bien chez les sujets lithiasiques que chez les sujets normaux.