Recherche de protéines mitochondriales interagissant avec l'ADN mitochondrial chez Drosophila melanogaster

Abstract

Nos travaux s’inscrivent dans le cadre de l’étude de l’expression du génome mitochondrial et portent sur la recherche de protéines mitochondriales interagissant avec l’ADNmt chez d. melanogaster. Deux approches ont été utilisées. La première consiste en l’isolement de complexes ADNmt/protéines natifs. Les conditions d’isolement de ces complexes ont été recherchées à partir de mitoplastes de cellules en culture kc0% marquées à la ³⁵S-méthionine et à la ³H-thymidine. Nos résultats montrent que, seuls que soient les détergents utilisés, il n’est pas possible de séparer l’ADNmt "natif" des protéines membranaires sans détruire totalement les structures mitochondriales ce qui suggère une interaction importante de l’ADNmt avec les structures membranaire. La deuxième approche consiste en une reconstitution de complexes nucléoprotéiques à partir de protéines mitochondriales transférées sur nitrocellulose et d’ADNmt. Deux techniques de transfert ont été testées : l’électrotransfert et le transfert par diffusion. Une étude de la spécificité des interactions révélées après l’utilisation de ces deux techniques montre que le transfert par diffusion est plus adapté pour nos investigations. Dans des conditions non stringentes, 14 bandes polypeptidiques, dont 12 majeures, sont révélées, de manière reproductible, par des sondes d’ADNmt marquées au ³²P soit par "nick-translation" soit par la T4 DNA-poly mérase. Les mêmes profils sont obtenus avec la région codante de l’ADNmt sous forme de fragments de restriction clonés dans pBR322 et avec l’ADNmt entier contenant la région riche en A + T non codante, connue pour interagir in vivo avec des protéines (Potter et al., 1980 PNAS 77 4118-4122). Les bandes polypeptidiques révélées appartiennent pour 6 d’entre elles (P.M. de 30 à 70kd) à la matrice mitochondriale et pour les 8 autres (P.M. de 10 à 70kd) à la membrane interne. Nous montrons que dans des conditions stringentes, les profils polypeptidiques sont modifiés, certaines des interactions étant conservées. Ces résultats ainsi que ceux obtenues lors de l’analyse, très préliminaire, de l’ADN retenu par les bandes polypeptidiques montrent que si l’ensemble des polypeptides révélés présente une affinité pour l’ADN en général, plusieurs d’entre eux reconnaissent l’ADNmt d’une manière plus spécifique.