Etude d'un plasmide cryptique et d'un gène de la voie de biosynthèse de spyrimidines de Lactobacillus plantarum

Abstract

Lactobacillus plantarum, bactérie lactique de la famille des lactobacillacées, est utilisée comme levain dans de nombreuses fermentations. Comme les autres bactéries lactiques, elle possède des caractéristiques physiologiques et génétiques particulières dont la compréhension permettrait de mieux maîtriser les conditions des fermentations lactiques. Ce travail constitue une participation à la mise au point d’outils génétiques en vue de l’étude au niveau moléculaire de la structure et de l’expression du génome de cette bactérie. Une partie du travail est consacrée à l’étude d’un plasmide de 2,1 kb, pLP1, qui a été isolé de la souche CCM 1904 de L. plantarum dans le but de construire un vecteur de transformation. Les résultats obtenus montrent que pLP1 est un plasmide cryptique codant pour une seule protéine indispensable à sa réplication et qui est capable d’agie en trans. Ce plasmide se réplique, chez L. plantarum et chez Bacillus subtilis par un mécanisme dit "cercle roulant" qui implique le passage par une forme d’ADN simple le brin. L’étude de la stabilité ségrégationnelle et structurale de vecteurs ayant pLP1 comme réplicon a montré les limites de son utilisation comme vecteur de clonage. La présence de séquences répétitives et palindromiques dans pLP1 rend l’ADN sujet à des recombinaisons par homologie de séquence ou même à des recombinaisons illigitimes favorisées par son mécanisme de réplication. Par ailleurs, l’origine de réplication du plasmide pLP1 a été localisée par des expériences de complémentation chez B. subtillis MI112. Une deuxième partie du travail concerne la détermination de la structure de pyrE, un gène de L. plantarum CCM 1904 codant pour un enzyme de la voie de biosynthèse des pyrimidines : l’orotate phosphoribosyl, de la conversion de l’orotate en orotidine 5’-monophosphate. L’étude de cette voie, responsable de la biosynthèse de novo des nucléotides pyrimidiques, a été entreprise en raison de son importance au niveau du métabolisme et de l’influence des concentrations des pyrimidines sur la croissance bactérienne. La gène pyrE a été cloné à partir d’une banque d’ADN génomique de L. plantarum CCM 1904 construite dans le plasmide pFL45, vecteur navette Escherichia coli/levure. La séquence du gène montre une phase ouverte codant pour une protéine de 212 acides aminés et ayant des similitudes avec les phosphoribosyl transférases d’autres microorganismes. Par ailleurs cette protéine a été mise en évidence par expression de plasmides contenant le gène pyrE dans des maxicells d’E. coli.