antimicrobial resistance of staphylococcus aureus in the northern west of portugal: molecular and pharmacological approaches

Abstract

En médecine vétérinaire et humaine, les agents antimicrobiens jouent un rôle important dans le traitement des infections bactériennes. Leur découverte au cours du XXe siècle a été considérée comme un miracule en soi, mais l'augmentation progressive de la résistance aux antimicrobiens qui a accompagné leurs utilisations dans les hôpitaux, au sein de la communauté, des animaux et dans l'environnement a bouleversé de nouveau la notion de l’efficacité des antibiotiques et leurs utilisations en médicine humaine ou vétérinaire. Au fil du temps, l'introduction de nouvelles classes de médicaments antimicrobiens s'est manifestée, souvent et rapidement, par l'émergence de microorganismes résistants. Dans ce registre le cas de la mammite bovine considérée comme l’une des maladies courantes, touchant les vaches laitières à forte incidence en est une bonne illustration. Le Staphylococcus aureus (S. aureus) bactérie à Gram positif considérée comme un pathogène humain important est aussi connu comme un des agents microbiens causant de plus des maladies liées à la mammite bovine. La mammite consiste en une inflammation de la glande mammaire, généralement développée en réponse à une infection bactérienne intra mammaire. Enfin, la mammite se reconnait aussi comme étant la maladie la plus importante rencontrée au sein des troupeaux laitiers. S. aureus revêt dans ce sens une importance particulière, car il est très infectieux et se caractérise par des taux de guérison significativement inférieurs par rapport aux infections causées par d'autres microorganismes. L'objectif majeur de cette thèse est d'aborder les mécanismes favorisant les phénomènes de résistance rencontrés chez les bactéries de S. aureus en utilisant un ensemble de tests génotypiques et phénotypiques, du S. aureus isolé des mammites dans le nord-ouest du Portugal. Ainsi, dans la première partie de cette thèse, nous nous intéressons à l'étude de l'activité antimicrobienne des bêta-lactamines et de la diversité du gène blaZ dans les isolats de S. aureus de mammite bovine d’origine nord-ouest du Portugal afin de montrer les mécanismes par lesquels le S. aureus peut conférer une résistance aux antibiotiques de la famille bêtalactamines et ce malgré la présence d’une grande diversité de différents groupes d'antibiotiques au sein de cette famille. En général, cette première étude visait à évaluer la sensibilité antimicrobienne de 52 isolats de mammite à S. aureus obtenus dans les années 2003-2004, 2007-2008 et 2017 dans le nord-ouest du Portugal contre des antibiotiques appartenant à la famille des bêta-lactamines; et de prévoir la prévalence, détecter et étudier la diversité des gènes de résistance blaZ et mecA dans les isolats positifs était aussi un des objectifs principaux de cette étude. D’après les résultats obtenus des isolats collectés à partir de l'antibiogramme au cours des périodes 2003-2004 et 2007-2008, nous avons trouvé que la résistance à l'aztréonam (groupe Monobactames) a été observée dans tous les isolats (100.0%), alors que la résistance à la Résumé xxii pénicilline (groupe Penicillines G) était considérablement plus élevée avec 76.9%, suivie par une résistance de 73.0% à l’ampécilline (groupe Aminopenicillins). La résistance à l'amoxicilline et à l'oxacilline n'était que de 3.8%, tandis que la sensibilité à l'amoxicilline combinée à l'amoxicilline/acide flavulanique était 100.0% (tous du groupe Aminopenicillins). Aussi, toutes les souches ont présenté une sensibilité de 100.0% aux autres antibiotiques étudiés parallèlement comme la céfazoline (groupe des céphalosporines), la pipéracilline (groupe des uréidopénicillines), l'imipénem (groupe des carbapénems) et la ticarcilline (groupe des carboxypénicillines). Cependant, les résultats obtenus par le biais de réactions de PCR ont montré que tous les isolats testés dans cette étude étaient positifs pour le gène de blaZ et un seul isolat qui a seulement été trouvé positif au gène du mecA. L'analyse phylogénétique du gène de blaZ détecté a placé les isolats dans 3 groupes différents qui sont étroitement liés à d'autres souches différentes de mammite bovine et de S. aureus d’origine humaine. Cependant, les nouveaux résultats obtenus à partir des nouvelles souches collectées en 2017 ont montré une nouvelle prévalence pour tous les antibiotiques testés tels que la pénicilline (27.0%), l'ampicilline (34.6%), l'oxacilline (65.4%), l'amoxicilline combinée à l'acide clavulanique (34.6%) et à la céfazoline (42.3%). De plus, un taux de résistance intermédiaire de 11.5%, 3.8%, 3.8%, 3.8%, 19.2% et 3.8%, respectivement, a été observé pour ces antibiotiques déjà décrits. Enfin, l'antibiotique pipéracilline a toujours montré une sensibilité permanente de 100.0% contre toutes ces nouvelles souches collectées. La comparaison de ces nouveaux résultats avec ceux des périodes 2003-2005 et 2007-2008 est très différente. Ainsi, nous avons pu observer une réduction notable, surtout pour la pénicilline (27.0% en 2017 au lieu de 76.9% pour la période de 2003 à 2008) et pour l'ampécilline (34.6% en 2017 au lieu de 73.0% en 2003 à 2008). En conclusion de cette première partie de cette thèse ; nous avons observé, en particulier dans le cas des isolats collectés de 2003 à 2008, une prévalence de résistance élevée dans les souches de S. aureus testés notamment contre la pénicilline et l'ampécilline alors que les autres groupes d'antibiotiques testés, au sein de la famille des bêta-lactamines, ont montré une activité atteignant les 100.0% contre cette bactérie pathogène de S. aureus. Parallèlement, une prévalence de 100.0% a été observée pour le blaZ, gène codant la résistance aux bêtalactamines. Cependant, l'analyse phylogénétique a placé les isolats dans trois groupes étroitement liés à différentes souches de mammite bovine et de souches de S. aureus d’origine humain, l'isolat 2 étant le plus divergent. Dans les groupes 1 et 3, la plupart des isolats sont liés à une forte prévalence de la résistance à la pénicilline et à l'ampécilline. En ce qui concerne les isolats présentant une susceptibilité phénotypique de 100.0%, ils sont généralement inclus dans le groupe/sous-groupe 1 et le groupe 2. Cependant nous avons, dans le cas des nouvelles Résumé xxiii souches collectées en 2017, noté une diminution de la prévalence de la résistance aux deux antibiotiques : pénicilline et ampécilline. Ceci pourrait être par exemple expliqué par les pratiques vétérinaires; car, en raison de la forte prévalence de résistance de S. aureus à la pénicilline et à l'ampécilline à travers le monde, de nombreux vétérinaires ont choisi d’éviter autant que possible ou définitivement l'utilisation et la prescription de ces deux antibiotiques bien connus dans le traitement des infections bactériennes, notamment pour les mammites causées par S. aureus en vue de la mauvaise réputation qui caractérise la famille des Bêtalactamines dans le monde à cause du phénomène de résistance. Ainsi, le fait d'éviter l'utilisation de ces antibiotiques dans les pratiques thérapeutiques, pour un temps assez long, pourrait conduire à l'inactivation des gènes responsables (tels que blaZ, mecA) de l’acquision de résistance du S. aureus à ces deux antibiotiques très connus en médecine. De plus, nous avons aussi observé l'apparition de souches résistantes intermédiaires au sein des nouvelles souches collectées durant 2017 d'une part, et l'apparition d'isolats présentant une résistance à un certain nombre d'antibiotiques comme l'amoxicilline combinée à l'acide clavulanique et la céfazoline, qui étaient 100.0% plus efficaces contre les isolats recueillis entre 2003 et 2008, d'autre part. Enfin, l'antibiotique pipéracilline a gardé son efficacité contre les souches plus anciennes collectées entre 2003 et 2008, et il s'avère également très efficace contre les nouvelles souches qui ont été récemment collectées en 2017. Il faut donc reconsidérer cet antibiotique pour combattre et traiter les infections à S. aueus provenant de la mammite bovine in vivo. La nouvelle analyse phylogénétique du blaZ de toutes les souches de S. aureus collectées au cours des années 2003, 2004, 2007, 2008 et 2017 a montré la diversité à l'intérieur ou entre différents troupeaux du nord-ouest du Portugal. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons essayé d’élargir notre étude pour inclure d'autres antibiotiques d’autres familles afin d'avoir une vision globale sur les profils de résistance de S. aureus issus de la mammite bovine dans le nord-ouest du Portugal. Ainsi, l'objectif de cette deuxième partie était de détecter certains gènes codant pour la résistance du S. aureus d’une part et d'étudier la prévalence et d'évaluer in vitro l'efficacité d'un ensemble d'antibiotiques contre les souches du S. aureus isolées à partir de la mammite bovine dans le nord-ouest du Portugal d’autre part. Pour cette raison, les tests de sensibilité aux antimicrobiens ont également été effectués par la méthode de diffusion sur disque, tandis que la détection des gènes tels que les enzymes modifiant les aminoglycosides (aph(3')-III-a, ant(4)-I-a et aac(6')- aph(2')), tetM, tetK, ermT, vanA, spc, lnuC, salA, vgaC et dfrK, était également réalisée par des méthodes spécifiques PCRs. Résumé xxiv D’après les résultats obtenus lors de cette étude, nous avons trouvé que sur les 52 isolats de S. aureus testés, 39 (75.0%), 35 (67.3%), 26 (50.0%), 22 (42.3%), 19 (36.5%), 17 (32.7%), 15 (28.8%), 12 (23.1%) et 11 (21.2%) ont présenté une résistance élevée plus particulièrement à la tétracycline, à l'érythromycine, à la vancomycine, à l'amikacine, à la kanamycine, à la clindamycine, à la gentamycine, à la tobramycine et au trimetroprim-sulfatomexazole, respectivement. En revanche, 18 (34.0%), 15 (28.8%), 14 (26.9%), 11 (21.2%), 7 (13.5% chacun) et 4 (7.7% chacun) ont présenté une résistance intermédiaire à la vancomycine, au triméthroprim-sulfatomexazole, à la tobramycine, à la gentamycine, à la tétracycline, à l'érythromycine, à la kanamycine, à la clindamycine et à l’amikacine. Parmi les gènes de dépistage, ant(4)-I-a, tetM, aph(3')-II I-a, dfrK, tetK, lnuC et spc ont été détectés dans 33 (63.5%), 30 (57.7%), 16 (30.8%), 10 (19.2%), 8 (15.4%), 3 (5.8%) et 1 (1.9%), respectivement. De plus, les gènes testés restants tels que vanA, ermT, salA, vgaC, aac (6') - aph (2') étaient tous négatifs. Tous les antibiotiques utilisés dans cette étude ont montré une efficacité remarquable et élevée sur toutes les souches collectées principalement entre 2003 et 2008. Alors que toutes les nouvelles souches collectées plus récemment en 2017 étaient, dans la plupart des cas, résistantes ou intermédiaires contre tous ces antibiotiques, montrant ainsi une évolution alarmante et dramatique de l'apparition de nouvelles souches très résistantes conduisant à repenser immédiatement voire à changer définitivement notre vision pour l’utilisation de ces antibiotiques avant que l'humanité déclare une capitulation totale aux nouvelles infections dues à S. aureus dans les quelques prochaines années. En conclusion de cette deuxième partie de cette thèse, nos résultats illustrent principallement la présence d'une forte prévalence de plus de 50.0% de résistance phénotypique dans les isolats de S. aureus testés contre la tétracycline, l'érythromycine et aussi contre la vancomycine. De plus, une prévalence élevée de 63.5% et 57.7% a été détectée, par PCR, pour ant(4)-I-a et tetM, respectivement. D'autre part, nous avons observé dans quelques cas que les résultats obtenus ont confirmé que la proportion d'isolats de S. aureus présentant une résistance phénotypique ne correspondait pas à celle des isolats identifiés avec les gènes détectés à savoir blaZ, ermT, tet les enzymes modifiant des Aminoglycosides gènes car par exemple certaines souches de S. aureus présentant 100.0% de sensibilité phénotypique pour tous les antibiotiques testés portaient également le gène blaZ. Des résultats équivalents ont été observés pour les gènes ermT et tet, les gènes des enzymes modificateurs des Aminoglycosides. L’explication de ce phénomène est trop détaillée dans la partie de discussion. Enfin, les résultats présentés dans cette étude pourraient être utiles pour concevoir des programmes spécifiques de lutte contre la mammite bovine causée par S. aureus dans la région nord-ouest du Portugal.